01 實(shí)驗(yàn)介紹

明暗箱實(shí)驗(yàn)也叫光/暗轉(zhuǎn)換測試 (LDT) ，是用于測量小鼠焦慮樣行為的*泛使用的測試之一。該測試基于小鼠對明亮區(qū)域的自然厭惡以及它們對輕度壓力源（例如新環(huán)境和光線）的自發(fā)探索行為。該測試對抗焦慮藥物治療也很敏感。測試裝置由一個(gè)盒子組成，盒子分為一個(gè)小（三分之一）暗室和一個(gè)大（三分之二）明亮的照明室。將小鼠放入照明的隔間中，并允許在兩個(gè)室之間自由移動。進(jìn)入暗室的第一個(gè)潛伏期和在亮室中花費(fèi)的總時(shí)間是小鼠明亮空間焦慮的指標(biāo)。由于隨著時(shí)間的推移習(xí)慣化，轉(zhuǎn)換是活動探索的指標(biāo)。LDT 快速且易于使用，無需事先對動物進(jìn)行培訓(xùn)。在這里，我們提出了我們的協(xié)議，該協(xié)議能夠檢測小鼠的抗焦慮樣（減少焦慮）和類焦慮（增加焦慮）行為。02 材料和試劑

1. 紙巾
   

2. 實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的小鼠
   關(guān)鍵注意點(diǎn)：小鼠在每籠 3-5 組中飼養(yǎng)，在 12 小時(shí)光照/黑暗循環(huán)（上午 7:00 開燈）下保持在溫度（~23°C）和濕度可控的房間內(nèi)，隨意獲得食物和水。
   

3. 70% 乙醇

03 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1. 用于明暗箱測試的設(shè)備由一個(gè)盒子（42 x 21 x 25 厘米）組成，盒子分為一個(gè)小（三分之一）暗室和一個(gè)大（三分之二）照明室。一個(gè) 3 厘米高、4 厘米寬的受限開口連接兩個(gè)腔室（如圖）。
   

2. 間接白光源
   

3. 數(shù)字照度計(jì)
   

4. 攝像機(jī)（直接放置在設(shè)備上方）
   

5. 用于手動分析的數(shù)字計(jì)時(shí)器或用于自動分析的計(jì)算機(jī)

04 動物行為分析軟件

• VisuTrack

• 1.系統(tǒng)擁有多種識別算法：智能識別法、灰度法、靜態(tài)背景法、動態(tài)背景法以及高斯背景法，可自動識別動物的活動狀態(tài)及睡眠狀態(tài)，并可生成可視化的矢量圖、運(yùn)動軌跡圖、熱圖（2D、3D）以及活動量圖（2D、3D）等；

2.系統(tǒng)擁有完善的外部輸入輸出控制，將行為與生物信號（腦電圖、血壓、神經(jīng)元活動、超聲波發(fā)聲）和實(shí)驗(yàn)刺激（聲音、光、電擊等）整合；
3.軟件對動物形體進(jìn)行全局分析，以檢測鼻尖（Nose position）、前部軀體中心（Forebody Center）、身體中心（Animal Center）和尾根（Tail Base position）四個(gè)特征點(diǎn)，并據(jù)此分析動物行為；
4.系統(tǒng)可以全自動分析更多實(shí)驗(yàn)動物的精細(xì)行為, 如爬行/靜止/原地微動,擺頭/甩頭,理毛修飾,轉(zhuǎn)圈,支撐站立,靠邊行走，嗅探，伸長，身體彎曲等，并可以生成相應(yīng)時(shí)間內(nèi)的動物行為圖譜及節(jié)律時(shí)序圖；
5.系統(tǒng)包含了GLP模塊（GLP Module），可以實(shí)現(xiàn)用戶權(quán)限、用戶策略分配，系統(tǒng)自帶管理員模式、審閱用戶模式以及實(shí)驗(yàn)員模式，對應(yīng)有不同的軟件使用權(quán)限，并可以導(dǎo)出符合GLP要求的操作日志表以及審閱日志表，同時(shí)可以開展動物行為“雙盲"實(shí)驗(yàn)；
6.同一套軟件可以在同一臺電腦上同一時(shí)刻在線或離線分析不同的動物行為實(shí)驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)效率的同時(shí)更增加了藥效評價(jià)的可靠性、實(shí)時(shí)性以及同步性，且分析結(jié)束后數(shù)據(jù)會自動按照實(shí)驗(yàn)類別歸類；

05 實(shí)驗(yàn)步驟protocol

1. 該設(shè)備放置在一個(gè)隔離的房間中，遠(yuǎn)離外部干擾和噪音，使用低強(qiáng)度白光源。
   

2. 實(shí)驗(yàn)者必須注意，不能在測試過程中發(fā)出任何過大的噪音以及佩戴氣味強(qiáng)烈的氣味產(chǎn)品，因?yàn)樗赡軐π∈螽a(chǎn)生焦慮刺激。
   

3. 光照室中的照明必須為 200-400 勒克斯或更高，而另一個(gè)室則為暗室（5 勒克斯或更低）。
   

4. 實(shí)驗(yàn)前將小鼠在其家籠中轉(zhuǎn)移到行為測試室至少 30 分鐘。
   

5. 用 70% 乙醇清潔設(shè)備的兩個(gè)隔間。
   

6. 打開相機(jī)并將一只老鼠放在明亮的房間中間。
   

7. 實(shí)驗(yàn)者盡可能遠(yuǎn)離盒子和測試動物的視線之外。
   

8. 允許動物在兩個(gè)腔室之間自由移動 5 分鐘。
   

9. 每次試驗(yàn)后，去除所有尿液和糞便，并用 70% 乙醇清潔兩個(gè)腔室。
   

10. 錄制的視頻可以通過VisuTrack動物行為分析軟件（上海欣軟）自動分析。對以下參數(shù)進(jìn)行評分（圖 2）：

• 進(jìn)入暗室的潛伏時(shí)間。

• 在明箱和暗箱中分別花費(fèi)的時(shí)間。

• 在明箱中的活動距離。

• 明暗箱進(jìn)入的轉(zhuǎn)換次數(shù)。

06 注意事項(xiàng)

• LDT 最初是由 Crawley 及其同事開發(fā)的（Crawley 和 Goodwin，1980）。原始版本和我們的測試有兩個(gè)不同之處。首先，原始版本的測試持續(xù)時(shí)間為 10 分鐘，而我們只使用了 5 分鐘的測試時(shí)間。其次，在原始版本中，照明隔間的墻壁是透明的，而我們使用不透明的白色塑料作為墻壁。因此，與原始版本相比，我們的改進(jìn)更具體地檢測明亮空間焦慮，其中也對開放空間焦慮進(jìn)行評分。
  

• 通常，雄性小鼠用于該行為實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榘l(fā)情周期的變化可能會影響雌性在此類測試中的表現(xiàn)。
  

• 基線活動可能因小鼠品系和年齡而異。
  

• 為了保證均勻的光度，使用間接光來避免陰影的產(chǎn)生，這可以成為動物的選擇。
  

• 在對每只動物進(jìn)行測試后，必須始終清潔兩個(gè)隔間，并在清潔后*干燥，因?yàn)榍鍧崉┑膹?qiáng)烈氣味可能會改變小鼠的行為。
  

• 僅當(dāng)動物將 2 個(gè)前爪和一半身體進(jìn)入其中時(shí)，才考慮進(jìn)入明亮或黑暗的隔間。如果動物用這兩只爪子返回隔間，則不記錄進(jìn)入。VisuTrack軟件有單獨(dú)的設(shè)置動物進(jìn)入?yún)^(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)（可自定義）。